貼壁生長的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長24h了，這個(gè)時(shí)間細(xì)胞已經(jīng)貼壁完全，而且這樣設(shè)置時(shí)間對(duì)自己安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間也方便。沒人愿意大半夜爬起來做實(shí)驗(yàn)吧。3、加藥后的孵育時(shí)間，我的實(shí)驗(yàn)摸了3個(gè)時(shí)間，24h，48h，72h。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇比較好的時(shí)間。太長了就沒有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了。4、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個(gè)問題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系，即細(xì)胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致。本人**終采用的是后者。5、cck8試劑加入后孵育時(shí)間，隨著時(shí)間的增加，OD值就會(huì)增大?？傊瓌t就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。**藥敏試驗(yàn)：這個(gè)是用的比較廣的，我見過做**的團(tuán)隊(duì)，買CCK-8都是一整箱，一整箱的買。上海cck8測ic50算法

CCK-8的用途1.細(xì)胞增殖測定：細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在很多領(lǐng)域都會(huì)用到，比如**相關(guān)、損傷后修復(fù)等。

2.***篩選：在測定一個(gè)***的毒性和安全有效濃度時(shí)，經(jīng)常會(huì)用到CCK-8。

3.細(xì)胞毒性測定：這個(gè)可以和各個(gè)處理因素對(duì)細(xì)胞活性和增殖的影響，比如在UV、低氧或者什么化學(xué)物品對(duì)細(xì)胞的影響上。

4.**藥敏試驗(yàn)：這個(gè)是用的比較廣的，我見過做**的團(tuán)隊(duì)，買CCK-8都是一整箱，一整箱的買，比如果子老師所在的團(tuán)隊(duì)，哈哈哈。

5.微生物對(duì)細(xì)胞的毒性或增殖的實(shí)驗(yàn)。 上海cck8注意事項(xiàng)CCK-8 反復(fù)凍融會(huì)增加背景值，干擾實(shí)驗(yàn)測定。

用途：

***篩選、

細(xì)胞增殖測定、

細(xì)胞毒性測定、

**藥敏試驗(yàn)等。

所需設(shè)備及儀器：

10ul，100-200ul及多通道移液器

酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）

96孔培養(yǎng)板

二氧化碳培養(yǎng)箱

培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)比較好條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

測定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

在做一些***毒性試驗(yàn)時(shí)，比如做鐵死亡途徑時(shí)，我們加入一個(gè)***叫C1，這個(gè)時(shí)候就需要提前換液，其實(shí)我們?cè)囘^，還是會(huì)有一些影響。所以這時(shí)我們用中性紅檢測。我們實(shí)驗(yàn)室，通常會(huì)用20%的硫酸銅溶液放到細(xì)胞孵箱下層，預(yù)防******。理應(yīng)說，硫酸銅分子在水溶液中是硫酸根離子和銅離子，是不會(huì)揮發(fā)的。但是每次只要是新?lián)Q的硫酸銅溶液再做CCK-8，結(jié)果總是不好，我也不知道是什么原因。之前在我們實(shí)驗(yàn)室有發(fā)生過這樣的事情，這種有深有淺的才是該有的結(jié)果。我想說的是在有能力選擇范圍內(nèi)，盡量選擇好一點(diǎn)的試劑，免得浪費(fèi)時(shí)間。無需放射性同位素和有機(jī)溶劑，對(duì)細(xì)胞毒性低.

特點(diǎn)不同1、CellCountingKit-8：靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好；操作簡便，省時(shí)省力；水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細(xì)胞；無需放射性同位素和有機(jī)溶劑，對(duì)細(xì)胞毒性低；適合于高通量***篩選。2、MTT法：特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。三、應(yīng)用不同1、CellCountingKit-8：主要用途為***篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、**藥敏試驗(yàn)。2、MTT法：***用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗*****篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及**放射敏感性測定等。細(xì)胞增殖與毒性檢測實(shí)驗(yàn)方法及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)-CCK-8 法.上海cck8 缺點(diǎn)

在電子耦合試劑（也就是細(xì)胞是活的，有呼吸，有能量代謝）.上海cck8測ic50算法

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1.先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。2.按比例(例如：1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。3.接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定O.D值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X軸)，O.D值為縱坐標(biāo)(Y軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量(使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間)。上海cck8測ic50算法