RT-PCR就是逆轉(zhuǎn)錄PCR或稱為反轉(zhuǎn)錄PCR（Reversetranscription-PCR，RT-PCR），是以RNA為材料應(yīng)用于PCR擴增中的一種實驗方法。首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA或信使RNA（mRNA）轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA）。其次TaqDNA聚合酶以cDNA為模板進行qPCR擴增。RT-PCR已被普遍應(yīng)用于多種分子生物學應(yīng)用中，包括基因表達分析、基因測試、RNA干擾驗證檢測、微陣列驗證、病原體檢測和疾病研究。RT-PCR的方法之一步法和兩步法：RT-PCR其操作方法分為兩種，即一步法和兩步法。一步法RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄同PCR擴增結(jié)合在一起，即cDNA合成與PCR擴增反應(yīng)在同一管Buffer及酶中進行，一步完成。兩步法RT-PCR，RNA首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，分成兩步進行。逆轉(zhuǎn)錄可用于新型病毒的檢測。南京彩色反轉(zhuǎn)錄企業(yè)

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項，隨機引物：適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，首先鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物（<500bp）的增加和長片斷、全長產(chǎn)物產(chǎn)物的降低。酵母菌逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶家族中的一個重要表示，逆轉(zhuǎn)錄在研究RNA表達調(diào)控等領(lǐng)域有普遍的應(yīng)用前景。深圳miQP2逆轉(zhuǎn)錄混合公司逆轉(zhuǎn)錄實驗盡量避免多次凍融處理RNA樣品，避免樣品質(zhì)量下降。

RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項：防止RNA模板的降解：毫無疑問，RNA質(zhì)量對cDNA合成結(jié)果會產(chǎn)生重要影響。但RNA很脆弱，易于降解。為了保證RNA的完整性，我們需要小心又小心，比如在冰上操作，用RNase-free的頭頭和離心管，減少操作時間等。在反應(yīng)體系中加入RNase抑制劑也能有效防止RNA降解。另外，建議在進行逆轉(zhuǎn)錄前，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA條帶的質(zhì)量。通常完整的真核RNA應(yīng)包括28S、18S條帶，且28S條帶強度一般是18S的兩倍左右。RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項：選擇合適的引物：OligodT引物和隨機引物都能進行逆轉(zhuǎn)錄。OligodT引物只能與mRNA的3’端poly(A)結(jié)合，沒有rRNA和tRNA的干擾，特異性強。

逆轉(zhuǎn)錄的過程：生物體中的逆轉(zhuǎn)錄過程就比較復(fù)雜，比如逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）。病毒是真正的“極簡風”，所有東西都壓縮到非常。比如它的基因組中，經(jīng)常有些基因是重疊、嵌套結(jié)構(gòu)，充分利用每一個堿基。所以它也不會專門編碼一個引發(fā)酶來合成引物，它一般是在組裝時帶走宿主的tRNA，在下次侵染時當作引物使用。被用作引物的tRNA會結(jié)合在病毒基因組RNA鏈的中間，所以首先次只能合成出一部分cDNA，然后利用基因組RNA兩端的一段重復(fù)序列，“跳”回另一端，完成整條鏈的逆轉(zhuǎn)錄。之后水解RNA鏈的時候，會留下一些片段作為復(fù)制的引物。雙鏈DNA的合成同樣也需要經(jīng)過一次跳躍（jump），以合成完整雙鏈。較后兩端具有相同的序列，稱為長末端重復(fù)（longterminalrepeats，LTR）。LTR不只包含跳躍時用來配對的序列，還有整合信號、啟動子、增強子、polyA位點等重要結(jié)構(gòu)。HIV病毒復(fù)制的一個重要步驟就是逆轉(zhuǎn)錄。

逆轉(zhuǎn)錄是指以RNA為模板合成DNA的過程，即將遺傳信息由RNA逆向傳給DNA的過程，其遺傳的傳遞方向與轉(zhuǎn)錄相反。反轉(zhuǎn)錄酶也可寫成逆轉(zhuǎn)錄酶又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。RNA指導的DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。逆轉(zhuǎn)錄是蛋白質(zhì)的先導RNA的合成方式。深圳miQP2逆轉(zhuǎn)錄混合公司

逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)應(yīng)用于人類基因組的研究。南京彩色反轉(zhuǎn)錄企業(yè)

逆轉(zhuǎn)錄引物：加尾法逆轉(zhuǎn)錄引物的結(jié)構(gòu)并不是想象中那么簡單的oligodT，其包含三個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)：①為了與PolyA序列互補配對，OligodT序列必不可少。②在OligodT序列的5端，存在一段通用序列，用于qPCR過程中反向引物與cDNA的結(jié)合。③OligodT序列的3端存在一個或兩個錨定堿基，V或者VN。(兼并堿基，V表示A、G或C，N表示ATCG中的任意一種)。如果沒有錨定堿基，逆轉(zhuǎn)錄引物中的OligodT就會隨機結(jié)合到PolyA的任意位置，這樣會造成同一miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度不一，給較后的熔解曲線檢測帶來麻煩。因此，錨定堿基的作用就是特異性地結(jié)合到miRNA上，從而讓逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合到緊挨著miRNA的那段PolyA序列上。只有這樣，才能夠保證同一miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小相同。南京彩色反轉(zhuǎn)錄企業(yè)