泛素化修飾機(jī)制研究方案總結(jié)

來(lái)源：發(fā)布時(shí)間：2024-08-27

1.疾病泛素修飾相關(guān)蛋白靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)

提煉科學(xué)問(wèn)題：根據(jù)臨床問(wèn)題，大量閱讀文獻(xiàn)，基于現(xiàn)有知識(shí)空白或臨床需求，明確研究目標(biāo)，可以是特定疾病中關(guān)鍵蛋白的泛素化調(diào)控機(jī)制，或是泛素化修飾異常分子與疾病發(fā)生的發(fā)展的關(guān)系等。

疾病關(guān)鍵蛋白泛素化調(diào)控機(jī)制研究：結(jié)合生物信息學(xué)在線工具（UbPred和GPS-Uber??），預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白的可能泛素化位點(diǎn)。同時(shí)使用質(zhì)譜定性檢測(cè)（如4D-Shotgun鑒定技術(shù)）對(duì)目標(biāo)靶蛋白進(jìn)行泛素化修飾的鑒定，確定具體的泛素化位點(diǎn)。

疾病異常的泛素修飾蛋白分子開(kāi)發(fā)：利用高通量質(zhì)譜技術(shù)（如4D泛素化修飾組學(xué)技術(shù)），鑒定疾病相關(guān)的泛素化修飾蛋白。

2. 疾病靶蛋白泛素化修飾的驗(yàn)證靶蛋白疾病功能驗(yàn)證：利用siRNA/shRNA敲減技術(shù)，過(guò)表達(dá)等技術(shù)，驗(yàn)證靶蛋白與疾病的關(guān)系。CoIP-WB檢測(cè)泛素化修飾：利用特異性抗體對(duì)修飾蛋白進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)，使用泛素化抗體WB檢測(cè)靶蛋白的泛素化水平。

3. 泛素連接酶與去泛素化酶的鑒定

CoIP-Mass檢測(cè)或或HuProt蛋白組芯片檢測(cè)技術(shù)：篩選與靶蛋白相互作用的泛素連接酶（E3）或去泛素化酶（DUBs）。同時(shí)結(jié)合在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)（UbiNet2.0和Ubibrower2.0）分析，快速鎖定修飾酶。

CoIP-WB或Pulldown-WB技術(shù)：檢測(cè)與靶蛋白相互作用的修飾酶。進(jìn)一步通過(guò)雙向CoIP結(jié)構(gòu)域截?cái)囿w互作驗(yàn)證，明確修飾酶和靶蛋白結(jié)合的功能結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞遺傳驗(yàn)證技術(shù)：利用siRNA/shRNA敲減、過(guò)表達(dá)等技術(shù)構(gòu)建修飾酶細(xì)胞遺傳模型，觀察靶蛋白泛素化水平的變化。

4. 泛素修飾類(lèi)型與靶蛋白修飾位點(diǎn)的鑒定

使用HA-Ub-WT/KO泛素修飾系統(tǒng)檢測(cè)修飾類(lèi)型：使用HA-Ub-WT和HA-Ub-KO（K6，K11，K27，K29，K33，K48和K63）載體，分別與泛素連接酶（E3）和修飾底物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)CoIP-WB檢測(cè)底物泛素化水平，明確泛素連接酶對(duì)修飾底物的泛素修飾類(lèi)型?；蛟俅问褂肏A-Ub-WT（K6R，K11R，K27R，K29R，K33R，K48R和K63R）載體，分別與泛素連接酶（E3）和修飾底物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)CoIP-WB檢測(cè)底物泛素化水平，再次明確泛素連接酶對(duì)修飾底物的泛素修飾類(lèi)型。使用靶蛋白修飾位點(diǎn)突變鑒定修飾位點(diǎn)：結(jié)合生物信息學(xué)在線工具（UbPred和GPS-Uber），預(yù)測(cè)可能的泛素化位點(diǎn)，構(gòu)建靶蛋白的位點(diǎn)突變體，與HA-Ub-WT質(zhì)粒和E3連接酶共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)CoIP-WB檢測(cè)底物泛素化水平，明確修飾底物的關(guān)鍵修飾位點(diǎn)。靶蛋白修飾突變體構(gòu)建驗(yàn)證：構(gòu)建靶蛋白的泛素化位點(diǎn)突變體，通過(guò)比較野生型與突變體的功能差異，驗(yàn)證泛素化位點(diǎn)的功能。