RIP-Seq/qPCR檢測驗證

來源：發(fā)布時間：2024-08-29

RIP-Seq是一種檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作組的高通量技術(shù)。該技術(shù)通過聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和RNA測序技術(shù)對目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的互作蛋白/RNA，進(jìn)行系統(tǒng)的檢測和分析。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白/RNA互作組數(shù)據(jù)檢測，或用于不同遺傳背景/實驗條件下的互作組差異研究。因此，該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)前置技術(shù)。

RIP-qPCR是一種檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作的靶向驗證技術(shù)。該技術(shù)通過聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和RT-qPCR檢測技術(shù)，對目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的蛋白/RNA互作關(guān)系進(jìn)行驗證，明確蛋白/RNA的相互作用關(guān)系。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白/RNA互作檢測驗證，或用于不同遺傳背景/實驗條件下的互作差異研究。因此，該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)檢測技術(shù)。

RIP-Seq檢測和RIP-qPCR驗證技術(shù)價值：

（1）蛋白與RNA相互作用數(shù)據(jù)，是探究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制研究的重要內(nèi)容，體現(xiàn)機制研究的深度，能明顯提升臨床基礎(chǔ)類研究文章的檔次。

（2）蛋白與RNA互作組檢測，常用于RBP蛋白的結(jié)合譜研究，如m6A-RIP-Seq。但理論上蛋白和RNA生物大分子，均有結(jié)合調(diào)控的可能。因此可用于目的蛋白結(jié)合RNA調(diào)控方向的機制探究，可用于是經(jīng)典老基因的機制突破。

（3）蛋白與RNA互作，其結(jié)合RNA的區(qū)域，是進(jìn)一步研究互作機制和功能的關(guān)鍵內(nèi)容，能夠明顯提高機制研究的高度。

RIP-Seq檢測和RIP-qPCR驗證要點：

（1）實驗設(shè)計：盡量進(jìn)行實驗組別設(shè)計和生物學(xué)重復(fù)檢測，提高后續(xù)驗證的陽性率。常規(guī)過表達(dá)單組（Ab IP vs IgG IP）；動態(tài)互作組學(xué)（實驗組vs對照組vs IgG組）。根據(jù)目的設(shè)計適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)重復(fù)。如果后續(xù)以RIP-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行互作組標(biāo)準(zhǔn)分析，則需要3-4組生物學(xué)重復(fù)；如果后續(xù)以尋找關(guān)鍵互作RNA，進(jìn)行深入的機制研究，則建議1-2次生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)驗顯示單次重復(fù)假陽性率達(dá)90%。RIP-Seq強烈建議設(shè)置實驗組別和生物學(xué)重復(fù)檢測。

（2）蛋白表達(dá)和細(xì)胞量：細(xì)胞用量要不少于5e7（金標(biāo)準(zhǔn)：320g離心細(xì)胞量50μl，保障項目用量）。本底低表達(dá)蛋白，建議使用過表達(dá)組進(jìn)行檢測。蛋白表達(dá)可根據(jù)WB結(jié)果或初步根據(jù)數(shù)據(jù)庫判定（Proteomics DB，Human Protein Atlas）。

（3）抗體關(guān)鍵質(zhì)控：抗體特異性與親和效價要求高，盡量采用標(biāo)簽抗體或經(jīng)過CoIP效果驗證的抗體?？贵w質(zhì)量參差不齊（WB能檢測到預(yù)期條帶不到1/2，能檢測到良好結(jié)果的不到1/4）和存在非特異性結(jié)合（幾乎所有的抗體都存在非特異結(jié)合，部分非特異結(jié)合條帶遠(yuǎn)大于目的條帶），RIP-Seq需做WB和IP-WB質(zhì)控?？贵w可參考數(shù)據(jù)庫（Validated Antibody DB)。

（4）IP送樣建議：由于RIP的產(chǎn)物量極少，需要微量建庫，強烈建議整包交給公司進(jìn)行RIP-Seq檢測和數(shù)據(jù)分析。

（5）互作蛋白篩選和驗證：數(shù)據(jù)分析以信號強度作為強陽篩選，以文獻(xiàn)查閱，功能匹配，批量RIP-qPCR驗證，提高驗證成功率。

RIP-Seq檢測和RIP-qPCR驗證優(yōu)劣勢：

優(yōu)勢：高通量獲得目的蛋白的專屬RNA互作庫，獲得目的蛋白的互作RNA機制分子。

劣勢：RIP-Seq的RNA庫魚龍混雜，包含目的蛋白的直接/間接的互作RNA，非特異結(jié)合，殘留RNA。RIP-Seq技術(shù)和分析門檻高；RIP-qPCR驗證成功率低，導(dǎo)致研發(fā)進(jìn)展反復(fù)跌宕、時間和經(jīng)費成本占用較大，嚴(yán)重影響士氣。該項目的成功實施，比較依賴成熟和有分析經(jīng)驗的團(tuán)隊，強烈建議整包交給專業(yè)的服務(wù)商開展檢測。

RIP-Seq互作組驗證，即在互作組分析篩選的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用RIP-qPCR技術(shù)對感興趣分子進(jìn)行靶向檢測，更加精細(xì)，也是互作組驗證的必由之路。成功驗證上岸的基礎(chǔ)是理想的互作組數(shù)據(jù)庫和豐富的分析經(jīng)驗，方能事半功倍。廣州基云生物，在IP互作組檢測和關(guān)鍵機制分子篩選驗證領(lǐng)域，具有豐富的經(jīng)驗，助力您的互作機制研究。